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Valor de Ct cuantitativo de fluorescencia de detección de ácido nucleico: un parámetro de amor-odio

Valor de Ct cuantitativo de fluorescencia de detección de ácido nucleico: un parámetro de amor-odio

El “Nuevo programa de diagnóstico y tratamiento de la neumonía por virus coronario (novena edición del ensayo)” utiliza un valor de Ct de detección de ácido nucleico ≥35 como una de las bases importantes para la liberación de la gestión del aislamiento o el alta.Entonces, ¿qué representa el valor Ct del kit de detección de ácidos nucleicos?¿Son comparables los valores de Ct de diferentes kits?¿Cuanto menor sea el valor de Ct, mejor será el rendimiento del kit?
El valor de Ct (Ciclo de umbral, Ct) es el número de ciclos de PCR cuando la intensidad de la señal de fluorescencia cuantitativa de fluorescencia en tiempo real supera el umbral establecido.Los kits de detección de ácido nucleico toman como ejemplo la nueva corona.Para la misma reacción del mismo kit para detectar dos muestras que contienen virus, A y B, el tamaño del valor Ct representa, en cierta medida, el número de copias del gen viral, es decir, la carga viral.Cuanto menor sea el Ct de la muestra B, mayor será la carga viral.El valor de Ct es inversamente proporcional a la carga viral y su infectividad.Los pros y los contras de los diferentes kits cuantitativos de fluorescencia en tiempo real no pueden juzgarse únicamente por el tamaño del valor de Ct, porque los valores de Ct de diferentes kits no son comparables.La evaluación del rendimiento del kit debe medirse desde los aspectos de sensibilidad (límite mínimo de detección), especificidad, precisión, estabilidad y aplicación diagnóstica.Cada fabricante de reactivos tiene sus propios dieciocho tipos de artes marciales, y tienen sus propios poderes mágicos en la aplicación, por lo que no entraré en detalles aquí.
Para los instrumentos/sistemas de análisis de PCR cuantitativa en tiempo real (QPCR) convencionales, la adquisición de valores de Ct y su uso generalizado en aplicaciones de detección de patógenos son familiares para todos.Con el desarrollo de la industria y el avance de la tecnología, los equipos y reactivos QPCR han encontrado oportunidades y desafíos.Yiou Think Tank (Informe de investigación de 2021 sobre la industria de pruebas genéticas de China: tecnología) analizó que la mayoría de las empresas en la industria de QPCR de mi país enfrentan problemas comunes basados ​​en la tecnología.En respuesta a estos problemas, las soluciones se dividen principalmente en dos tipos: acelerar la mejora tecnológica y desplegar nuevas tecnologías.
POCT para el diagnóstico molecular QPCR es una de las direcciones de desarrollo de la industria, y la mejora del rendimiento es un factor importante para acelerar la aplicación de la tecnología.Para equipos POCT con rendimiento de QPCR de una sola muestra, ¿cómo optimizar el valor Ct del parámetro clave de una sola reacción en I+D?El mismo equipo, el mismo sistema de reacción y la misma concentración de plantilla, teóricamente cuanto mayor sea el valor de Ct de una sola reacción, menor será la eficiencia de la enzima en la reacción.
En el proceso de mejorar la eficiencia de la reacción enzimática y optimizar el valor de Ct, se puede analizar primero una curva típica de amplificación cuantitativa de fluorescencia de 40 ciclos de PCR.La curva de amplificación de la siguiente figura se divide en fase de fondo de fluorescencia, fase de amplificación exponencial, fase lineal y fase de meseta.Para lograr un fondo de fluorescencia más bajo, en la medida de lo posible para distinguirlo del valor de fluorescencia de la amplificación exponencial temprana, es necesario realizar pruebas desde el portador de consumibles de reacción, la detección del diseño de la sonda del cebador y el sistema de tampón de reacción.El período de amplificación exponencial es la reacción más directa de la actividad enzimática, y también es la prueba de la perfecta coordinación del equipo POCT, los portadores de reacción y los reactivos.En este momento, el control de temperatura del equipo, la adquisición y el análisis de señales ópticas, la biocompatibilidad del portador y el rendimiento del sistema de los reactivos deben ajustarse y probarse en todos los aspectos.Finalmente, se completa toda la amplificación y los resultados deben presentarse mediante un algoritmo de datos riguroso para obtener un valor de Ct razonable.
línea de TC
Un pequeño paso en la optimización del valor Ct son los innumerables pasos del personal de I+D.En la ansiedad y la emoción del día y la noche, cada vez que “las montañas y los ríos no se ven por ninguna parte, los sauces están oscuros y las flores brillan y hay otro pueblo”, lo que nos da el coraje y la pasión para seguir adelante. otra vez.


Hora de publicación: 29-sep-2022